2020年2月28日，清华大学生命学院、北京生物结构前沿研究中心李丕龙课题组与中国科学院生物物理研究所李国红课题合作在《细胞研究》（Cell Research）上发表题为“雷特（Rett）综合征突变削弱了甲基化CpG结合蛋白2 (MeCP2)介导的染色质液-液相分离形成”（Rett syndrome-causing mutations compromise MeCP2-mediated liquid-liquid phase separation of chromatin）的学术文章。
Rett综合征是一种严重的产后神经发育障碍疾病，主要是由编码甲基CpG结合蛋白2（MeCP2）的X连锁基因（X-linked gene encoding）突变引起的。MeCP2包含无序（disorder）的N末端结构域（N-terminal domain, NTD），甲基CpG结合域（methyl-CpG binding domain, MBD），中间结构域（intervening domain, ID），转录抑制域（transcription repression domain, TRD）和无序的C末端结构域（C-terminal domain , CTD）。另外，MeCP2的C末端结构域（CTD）包含三个AT挂钩基序（AT hook motifs），它们优先结合富含AT的DNA序列。MeCP2可调节染色质的基因表达，而Rett综合征突变（即引起Rett综合征的MeCP2突变）会影响此功能。MeCP2最初被认为是一种转录抑制因子，有人提出MeCP2是通过其转录抑制结构域（TRD）与其他转录抑制因子（如含组蛋白脱乙酰基酶-histone deacetylase的共阻遏物复合物Sin3A和NCoR/SMRT）相互作用而在转录阻遏中发挥重要作用，从而产生局部低乙酰化的沉默的染色质状态。此外，也有充分的文献证明MeCP2能够通过独立于组蛋白去乙酰化和DNA甲基化的机制抑制转录。MeCP2在所有细胞类型中普遍存在，但是在神经元中表达最高；同时神经元中连接组蛋白H1（linker histone H1）表达量相应的减弱。大量体外实验表明，MeCP2可以通过与连接组蛋白H1竞争染色质的结合位点进而压缩（compact）核小体串来形成更高级的染色质结构和架构。此外，体内研究表明，MeCP2缺乏会导致神经元中的连接组蛋白H1表达水平增加以及染色质组织结构的整体变化，这表明MeCP2可以作为一种替代连接组蛋白H1的染色质结构蛋白。
图：神经元中MeCP2和H1的相分离液滴分布模型
最近，李丕龙和李国红课题组以及其他课题组的研究表明液相-液相分离（liquid-liquid phase separation, LLPS）驱动HP1介导的异染色质的形成，从而为调节异染色质装配和功能的机理提供了新的视角1-5。与此相符的近期体内研究表明，MeCP2也能够将整体异染色质结构重新组织并聚集成点状（puncta）结构，称为染色质中心（Chromocenters）。这表明MeCP2也可能通过LLPS介导异染色质的形成。在本次工作中，李丕龙和李国红课题组首先验证了MeCP2可以在体外压缩体外组装的核小体串（nucleosomal arrays）（MeCP2,核小体串均为超低浓度，电子显微镜-EM和超离心分析-AUC），以及首次证明MeCP2与核小体串可以形成液-液相分离现象（MeCP2,核小体串均为相对高浓度，共聚焦显微镜-Confocal microscopy）。作者也证明了MeCP2不同结构域截短对应压缩核小体串以及形成LLPS能力非常吻合，这表明染色质紧实度可能与异染色质形成中的LLPS相关。作者进一步证明了多价DNA甲基化的存在可以进一步增强MeCP2形成染色质LLPS的能力。有趣的是，作者发现Rett综合征突变（无义突变-Nonsense mutations以及错义突变- Missense mutations）减弱或破坏了MeCP2介导的染色质LLPS，而良性变体（即不引起Rett综合征的MeCP2突变）对此过程几乎没有影响。此外，作者首次介绍了连接组蛋白H1（linker histone H1）也可以与核小体串发生LLPS，并且发现MeCP2与连接组蛋白H1在与染色质/核小体串形成LLPS时存在竞争行为：在体外形成互斥的染色质相分离液滴，在体内形成独特的异染色质斑点。Rett综合征突变降低或甚至消除了MeCP2与连接组蛋白H1竞争并形成染色质相变液滴的能力。总结来说，首次报道了MeCP2通过LLPS新机制介导异染色质的形成，并揭示了MeCP2介导的染色质相分离与Rett综合征病理学之间的潜在联系。
清华大学生命学院、结构生物学高精尖创新中心李丕龙研究员、中国科学院生物物理研究所李国红教授为本文的共同通讯作者。清华大学生命学院2015级博士生王亮、中国科学院生物物理研究所2015级博士生胡明丽为本文共同第一作者。这一课题的化学交联质谱实验得到了北京生命科学研究所（NIBS）董梦秋课题组以及北京大学第一医院包新华课题组的大力帮助。此外我们非常感谢王小群博士像我们提供了小鼠脑切片，胡克平博士提供了MeCP2质粒，以及周兆兰博士关于文章写作与我们进行了重要的讨论。我们感谢清华大学尼康生物影像中心以及中国科学院生物物理研究所的蛋白质科学核心设施生物成像中心对我们在荧光或电子显微镜数据采集及分析方面的协助。本工作得到国家科技部基金、国家自然科学基金、中国科学院战略重点研究计划、中国科学院前沿科学重点研究计划、HHMI国际研究奖学金支持、清华-北京生命联合中心、北京市结构生物学高精尖创新中心的经费支持。
1. Wang, L. et al. Histone Modifications Regulate Chromatin Compartmentalization by Contributing to a Phase Separation Mechanism. Mol Cell, doi:10.1016/j.molcel.2019.08.019 (2019).
2. Gibson, B. A. et al. Organization of Chromatin by Intrinsic and Regulated Phase Separation. Cell 179, 470-484.e421, doi:10.1016/j.cell.2019.08.037 (2019).
3. Larson, A. G. et al. Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature 547, 236-240 (2017).
4. Larson, A. G. & Narlikar, G. J. The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation. Biochemistry 57, 2540-2548, doi:10.1021/acs.biochem.8b00401 (2018).
5. Strom, A. R. et al. Phase separation drives heterochromatin domain formation. Nature 547, 241-245, doi:10.1038/nature22989 (2017).
